植物抵抗酸性土壤铝毒害的分子基础 | 目的地Destination

植物抵抗酸性土壤铝毒害的分子基础

植物抵抗酸性土壤铝毒害的分子基础

世界上大约50%的可耕土壤是酸性的,酸性土壤的铝(Al)毒害是重要的作物生产限制因素。在pH值低于5时,三价Al离子从粘土矿物中溶解,对植物根部具有相当大的毒性。Al能快速抑制根系生长,抑制根系功能,进而导致干旱和矿质元素缺乏,导致作物产量下降。Al毒性涉及其与根细胞壁、质膜和相互作用,近年来在作物铝抗性的分子、遗传和生理研究方面取得了相当大的进展。

一,植物铝抗性和耐受性策略

已经证实的两种主要类型的Al抗性机制:

1,Al排除机制,其目的在于防止Al进入根尖(包括共质体和质外体);

2,Al耐受机制,使Al进入植物并且被解毒、隔离。

接下来将重点介绍已经鉴定或提出的铝抗性机制,概述Al从根际移动到根部,并在某些情况下进入枝条时遇到的不同机制。

1. 铝外排机制

外排机制涉及从根尖释放有机化合物,有机酸是Al外排机制中释放的主要化合物。一些实验证据表明,酚类化合物的释放也可能在这种机制中发挥作用。

1.1 有机酸的释放作用于铝外排机制

到目前为止,研究最透彻的Al外排机制,是Al介导的有机酸(OA)阴离子从根部渗入根际,并在根际螯合三价Al离子,形成无法进入根部的无毒化合物。

早在20世纪90年代对菜豆(Phaseolus vulgaris)和小麦(Triticum aestivum)的开创性生理学研究表明,Al毒抗性与Al依赖的有机酸(菜豆根中的柠檬酸和小麦根中的苹果酸)释放水平之间存在明显的相关性。这引发了后续一系列对单子叶植物和双子叶植物的大量研究,这些研究证明了Al抗性的强弱和Al激活的来自根的苹果酸、柠檬酸和草酸(少数一些物种中)的渗出之间相关。

采用这种Al抗性机制的植物物种之间的主要差异是(1)释放OA(苹果酸,柠檬酸或草酸)的特性,(2)OA释放量的大小,和(3)铝诱导OA释放需要的时间。尽管许多植物物种释放一种OA,但是也发现一些植物物种,可以释放两种或以上OA以响应Al胁迫(例如小麦和拟南芥中的苹果酸盐和柠檬酸盐),这表明存在着多种释放机制或转运蛋白。

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Plant species where Al-activated root organic acid exudation is correlated with Al tolerance

在20世纪90年代末,关于铝抗性机制的电生理学研究,用从Al抗性小麦和玉米的根尖分离的原生质体,证明了特定质膜阴离子通道的存在,首次提出了介导OA从根向外转运的分子机制。随着第一个Al抗性基因被克隆,在小麦、高粱和大麦中也都克隆出了编码苹果酸和柠檬酸转运蛋白的基因。随后的研究证实,膜转运蛋白的两个家族的成员:Al激活的苹果酸转运蛋白(ALMT)家族和OA/H反向转运蛋白(MATE)家族,负责响应Al毒,将苹果酸和柠檬酸从植物根细胞释放进入根际。

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General model illustrating mechanisms of Al resistance (Al exclusion and Al tolerance/detoxification)

1.2 有机酸以外的化合物释放也能作用于铝外排机制

根系能释放出很多类型的有机化合物,其中一些化合物,如酚类,具有螯合根际中的Al离子的能力。酚类化合物是不十分有效的Al螯合剂,但酚醛环的-OH基团中的氧原子赋予其Al离子螯合能力。Kidd等人确定,响应Al处理后,Al抗性基因型玉米的根部渗出酚类化合物儿茶酚、儿茶素和槲皮素,他们推测根系释放的酚类物质可能与柠檬酸一起在铝外排抗性中发挥作用。在应对铝胁迫时,抗铝玉米品种的根系内含有较高的咖啡酸、儿茶酚和儿茶素水平。表明这些有机物可能也参与铝毒害的内部耐受。

其他几项研究也表明了根酚类物质在内部Al耐受中的作用。Tahara等发现,响应Al胁迫后,高抗的樟树(Cinnamomum camphora)和赤桉树的根合成月见草素B(一种含有几个相邻酚羟基的二聚水解单宁),它们可以作为有效的Al结合配体。根中的月见草B含量较高,且5种树木的铝抗性与月见草B含量呈正相关。另一份关于樟树的报告提出了一种独特的酚类介导的根Al排除机制。在这项研究中,作者确定了一个特殊的根外细胞层,抗性物种在这里积累了更高水平的黄酮类原花青素。他们提出,这个与根表皮细胞外层相邻的细胞层不断生长并逐渐从根部脱离,从而防止根系中Al积累,对根起到保护作用。鉴于这些研究,酚类化合物在铝外排和内部解铝毒机制中的作用可能会引起额外的关注。


2. 铝耐受机制

我们对植物耐受铝毒害和解铝毒机制的大部分认知来源于对抗铝植物的研究,特别是水稻(Oryza sativa)和Al高积累植物,如荞麦(Fagopyrum esculentum)和绣球花(Hydrangea macrophylla)。根据水稻的生理学、分子生物学和遗传学研究,高抗性物种拥有多种抗铝基因和机制,其中许多涉及根的内部铝耐受。Al耐受机制要么是涉及对细胞壁的修饰(大部分的Al结合在细胞壁[85%-99.9%]),以改变细胞壁的性质,要么是一旦将铝吸收后,螯合成低毒的复合物储存在液泡或转移到地上的铝不敏感区域。

2.1 细胞壁修饰

对于穿过根际OA屏障的Al离子,根细胞壁构成Al与植物相互作用的下一个位点。初生根细胞壁是一种复杂的异质结构,由嵌入果胶和半纤维素基质中的纤维素微纤丝组成。Al离子可以与壁果胶中的带负电荷的羧基进行静电相互作用,并吸附到不带电荷的半纤维素聚合物上。有学者提出,Al通过与细胞壁相互作用,改变细胞壁性质(降低壁可塑性/弹性),影响重要的细胞壁酶(如使细胞壁扩展蛋白中毒),打破细胞壁可溶性Al的平衡状态,从而产生毒性。

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A simplified schematic depicting the structure of the primary cell wall and the action of cell wall modifying proteins

在细胞壁的复杂调控网络中,细胞壁修饰酶的活性显著影响细胞壁碳水化合物结构性质的变化。最显着的是扩展蛋白、β-1,4-葡聚糖内切酶、木葡聚糖转葡糖基酶/水解酶XTH和果胶甲酯酶。Al与果胶的结合,主要是果胶中负电羧基基团的高亲和力引起的,细胞壁的负电荷是由果胶甲基化的程度决定的,果胶甲基化是由果胶甲酯酶的活性引起的。

后续研究证明了果胶甲酯酶在铝抗性中的作用,表明不同基因型的玉米、荞麦和水稻对于铝抗性的差异与根尖细胞壁中果胶甲基化程度的差异显著相关。在铝胁迫下,耐铝品种根中果胶的甲基化水平更高,且具有较低的果胶甲酯酶活性。这导致细胞壁内的净负电荷水平较低,减少了细胞壁中Al 离子的结合和积累。此外,马铃薯(Solanum tuberosum)和水稻根中果胶甲酯酶的过量表达导致根尖细胞壁中Al含量增加,敏感性增强。

对于Al在拟南芥细胞壁的结合,半纤维素与果胶同样重要,半纤维素也可能在铝毒抗性中发挥作用。Al胁迫能够抑制拟南芥细胞壁的木葡聚糖转葡糖基酶XET,该酶在细胞伸长期间切割并重新结合半纤维素木葡聚糖聚合物。研究表明,XTH31是一个受Al胁迫影响的XET基因, xth31 突变体的Al抗性的增加。作者提出,Al毒性涉及细胞壁中的木葡聚糖代谢,减少细胞壁中裂解的木葡聚糖产生可能会增加Al抗性。

对水稻Al耐受性的研究表明,高水平的Al抗性涉及多种基因,这些基因与不同的Al耐受机制有关。与其他谷物相比,水稻在水中生长,稻田的水每天都在渗漏和补充。虽然MATE柠檬酸转运蛋白OsFRDL4介导了水稻根系的Al外排机制,由于水稻根际微环境时常变化,根系OA释放对水稻铝抗性的作用较小,因此铝耐受基因和机制对水稻更为重要。通过对Al敏感突变体的图位克隆,鉴定出参与水稻Al耐受的基因 STAR1和STAR2(Sensitive To Al Rhizotoxicity 1/2 ),这一对基因编码的ABC转运蛋白复合物介导了UDP-葡萄糖向细胞壁运输,可能改变了细胞壁的组成,导致Al结合能力降低,进而耐受铝毒。

2.2 铝转运在铝耐受机制中的作用

近年来的研究也揭示了细胞膜和液泡膜上的Al转运蛋白在植物Al耐受机制中的作用。由于人们普遍认为铝具有很高的植物毒性,对于铝转运到植物细胞中的解毒机制似乎很难理解。

铝能抑制根生长并破坏细胞壁功能相关的酶,然而在水稻中,根系可以耐受细胞壁中高水平的铝。一种可能的方式就是将铝从细胞壁吸收到细胞质,将其运输、螯合并隔离在液泡中。研究发现,质膜转运蛋白OsNrat1将Al转运到根的细胞质,然后液泡膜上的ABC转运蛋白OsALS1协同作用,将其隔离在根细胞的液泡中。

2.3 铝高积累植物及其耐受机制

一些植物物种,包括绣球花、荞麦、野牡丹(Melastoma malabathricum)和茶(Camellia sinensis),能够在枝条中转移和积累Al,浓度高于1,000mg/kg,甚至超过3,000mg/kg。这些研究揭示了Al高积累植物的几个耐受特征,包括1,Al在根茎、叶片中分别以无毒的柠檬酸盐(绣球花)和草酸盐(荞麦)的形式积累;2,在绣球花中,Al在萼片中和3-葡萄糖苷花翠素(delphinidin-3-glucoside)、3-咖啡基奎宁酸(3-caffeolylquinic acid) 形成蓝色复合物并积累,使叶片颜色由粉变蓝;,3,在荞麦中,木质部汁液的铝与柠檬酸而不是草酸络合,说明当Al加载到木质部时,经历了草酸盐与柠檬酸盐的配体交换,在转移到叶片时,配体会交换回草酸盐。目前已经鉴定出两个参与绣球花Al积累的细胞膜(HmPALT1)和液泡膜(HmVALT)铝转运蛋白,这些转运蛋白是水通道蛋白家族的成员,并且在萼片细胞中高度表达。


3. 跨膜转运蛋白在解铝毒中的作用

Al外排机制涉及根将OA释放到根际,第一个Al抗性基因是从小麦鉴定的苹果酸转运蛋白。自这一开创性研究后,不同物种中ALMT和MATE家族的苹果酸转运蛋白的柠檬酸转运蛋白逐渐被鉴定。然而,随着Al抗性相关基因的扩展和我们对其他Al抗性机制理解的深入,发现其他类型的膜转运蛋白也在Al抗性中起作用,包括Nramp家族、ABC转运蛋白家族以及水通道蛋白家族的成员,下面将介绍这些不同转运蛋白的功能及其在植物铝抗性中的作用。

3.1 ALMT 苹果酸转运蛋白

从Al抗性小麦和玉米根尖分离的原生质体进行电生理学(膜片钳)研究,提出质膜上存在受Al调控的苹果酸和柠檬酸外排转运蛋白。这些阴离子转运蛋白的性质与根中报道的Al诱导的苹果酸释放反应之间的相关性表明这些阴离子通道是Al激活的根OA释放的基础。通过克隆这些转运蛋白验证了这一点,首先鉴定出TaALMT1,编码小麦苹果酸外排通道的基因。

TaALMT1 是第一个鉴定出的Al抗性基因,是小麦抗性基因座(AltBH)上的主效基因。在爪蟾卵母细胞和烟草(Nicotiana tabacum)细胞中表达TaALMT1,证明其编码转运蛋白,介导苹果酸顺电化学梯度被动流出。虽然该蛋白在细胞外没有Al的情况下是有功能的,但其转运活性是受细胞外的Al作用增强的。TaALMT1在转基因水稻、小麦和大麦以及烟草悬浮细胞中的表达,增强了Al激活的苹果酸释放并增加了Al抗性。TaALMT1在小麦中的功能与异源表达实验的结果相似,表达TaALMT1的转基因植物和Al抗性小麦根中Al激活的苹果酸释放证实了其作为Al抗性蛋白的作用。

尽管ALMT家族最初是因为Al抗性得以命名,但后来的研究很快就发现,并非所有ALMT家庭成员都参与这一特性。已经在玉米(ZmALMT1 ZmALMT2)和大麦(HvALMT1)中鉴定出了定位在植物根细胞膜的ALMT转运蛋白,它们的转运活性不响应Al,并且ZmALMT1转运无机阴离子而不是苹果酸。越来越多的研究表明,ALMTs在植物中的作用不仅仅涉及Al抗性,它们还影响矿物营养、离子稳态、膨压调节和保卫细胞功能。

ALMT具有高度相似的二级结构,有六个跨膜结构域(TMD)的高度保守N-末端区域,随后是一个可能含有一个或两个以上TMD的可变长亲水性C末端。由于它们对无机阴离子和苹果酸(在大多数情况下)具有渗透性,因此ALMT家族成员在运输过程中具有相似性,包括运输底物的特性。Al诱导的底物运输活性增强似乎是根部定位的ALMT作用于抗铝毒的关键。

功能研究表明,ALMT的C末端在Al诱导的底物运输活性增强中起重要作用,然而关于转运蛋白的拓扑结构仍然缺乏共识,特别是C末端是在细胞内还是在细胞外。TaALMT1蛋白的结构-功能分析和ALMT家族的系统发育分析表明,较短的N末端结构域也参与Al诱导的底物运输活性增强,表明ALMT的N末端和C末端共同作用于Al响应。除了细胞外的Al能调节ALMT1的转运活性外,广谱蛋白激酶和磷酸酶抑制剂实验表明,这些转运蛋白通过可逆蛋白磷酸化进行翻译后修饰调节其底物转运活性。电生理学研究表明,蛋白激酶抑制剂对TaALMT介导的底物转运具有快速和强烈的抑制作用,而蛋白激酶活化剂PMA增强了TaALMT1介导的阴离子释放。

3.2 MATE 柠檬酸转运蛋白

质膜定位的MATE转运蛋白家族成员负责响应于Al胁迫,并将根的柠檬酸分泌到根际作用于抗铝毒。 MATE最初是通过图位克隆,在高粱和大麦中鉴定出的抗铝毒基因座中的主效基因。随后,在拟南芥(AtMATE1)、玉米(ZmMATE1)、饭豆(VuMATE1)和水稻(OsFRD1)中都发现了MATE的同源基因,它们也作为柠檬酸转运蛋白参与Al抗性。ALMT和MATE都通过根释放赋予OA参与抗铝毒,然而这两个蛋白在结构和功能上完全不同,这也体现了植物对于解铝毒这一性状上的趋同进化。

目前关于ALMT运输性质的研究比MATE更多更清楚。功能上,通过卵母细胞电生理学和碳14外排研究,发现高粱(SbMATE)以及玉米(ZmMATE1)和饭豆(VuMATE1)中的MATE通过“柠檬酸盐/H(或Na )”反向运输机制介导柠檬酸流出。因此,ALMT苹果酸转运蛋白作为阴离子通道起作用,而MATE柠檬酸转运蛋白是介导与质子流入偶联的柠檬酸外排。令人费解的是,反向运输机制通常用于介导底物的主动运出,该过程与被动质子流入偶联,来促进热力学上不利于进行的柠檬酸外排,可能这种偶联对向根际释放碳的过程赋予了额外的调节。

3.3 C利用效率和根系有机酸释放

许多植物的铝抗性机制涉及根系释放的有机酸螯合铝离子,其中苹果酸和柠檬酸是三羧酸循环中的关键中间代谢产物。因此,这种Al抗性机制需要消耗含碳化合物作为代价,同时这种抗性机制也会在对Al的响应过程中受到复杂的调控。

实验证据表明,Al激活的苹果酸和柠檬酸渗出物定位于根尖,这种空间定位保证了含碳化合物成本的降低,因为铝毒害主要作用于根尖,只需要保护根尖不受Al毒的损害就不影响根的伸长。

使用激光捕获显微切割耦合高灵敏度qRT-PCR测定,显示Al诱导的SbMATE基因表达特异性定​​位于高粱根远端过渡区(DTZ)的表皮和外皮层细胞层(细胞分裂与细胞伸长之间的根区域),证明这也是最大的Al诱导损伤的位点。

许多物种中,这些转运蛋白需要通过翻译后激活,才能释放OA阴离子。因此,只有在根际有足够水平的Al离子,才需要根部保护免受毒性作用时,根才能释放苹果酸和柠檬酸。因为酸性土壤在pH和铝饱和度方面通常在空间上非常不均匀,并且酸性土壤pH在相对较小的距离上可以有很大变化。

另外,柠檬酸是一种比苹果酸强得多的Al离子螯合剂,在抗铝毒方面比苹果酸的作用强大约八倍。因此,基于柠檬酸的Al抗性机制可能是更经济有效的过程。使用过表达AtALMT1和AtMATE的转基因拟南芥,发现柠檬酸和苹果酸释放会对根系生长造成影响。在没有Al的情况下,这些转基因拟南芥根的苹果酸和柠檬酸释放率是野生型植物的两倍至十倍,并且与野生型植物相比,根生长被抑制20-30%。这些研究表明,为了限制这种Al抗性机制造成的有机含碳化合物的浪费,植物需要释放出最少量但足量的OA阴离子来缓解根际的铝毒。

3.4 Al的Nramp转运蛋白

通过对水稻C2H2锌指转录因子ART1进行功能分析,鉴定了许多受Al调控的涉及多种抗性机制的Al抗性基因。包括质膜定位的 Nramp家族 Al摄取转运蛋白OsNrat1,它可以与液泡ABC转运蛋白OsALS1协同作用,从细胞壁中除去Al并将其置于根细胞液泡中。与高粱、小麦和大麦不同,水稻主要通过耐受根中的铝来应对铝毒害。因为多达90%的Al存在于细胞壁中,Nrat1可以通过降低细胞壁铝的水平,赋予Al耐受性。

Nrat1属于Nramp家族转运蛋白,但是与其他Nramps成员没有太大的功能相似性。 OsNrat1特异性转运Al离子,但不转运其他Nramps的底物,如Fe、Mn、Cd 等二价金属离子。Nrat1的表达受Al诱导快速上调,但不受低pH或其他类似金属如镉和镧影响,其表达定位于除表皮细胞外的所有根细胞的质膜。

水稻Al耐受性的全基因组关联分析(GWAS)鉴定了一种Nrat1单倍型,这种单倍型对于水稻亚群是独特的,并解释了该亚群中40%的耐受性表型变异。 Nrat1编码区和调控区中的DNA序列变异与Nrat1表达和Nrat1对Al的转运特性变化相关,使得耐受性Nrat1等位基因比这些敏感等位基因更高表达,转运更多的Al。令人惊讶的是,转基因拟南芥中耐受性和敏感性Nrat1等位基因的表达,增加了Al抗性和根对Al摄取,耐受等位基因赋予更强的铝抗性。水稻Nrat1的另一项遗传多样性分析也鉴定了耐受和敏感的等位基因,这些等位基因与表达差异有关,但与底物运输能力无关。

总之,这些研究表明Nrat1通过在根细胞内转运和隔离,降低根细胞壁中的Al水平,进而在水稻中起重要的抗铝毒功能。有趣的是,水稻Nrat1增强了水稻和拟南芥的抗铝性,水稻的根系铝外排机制作用并不很明显,而拟南芥中铝外排机制却发挥重要功能。因此,Nrat1及其直系同源基因可能是增强多种植物物种中Al耐受性的有力工具。

3.5 Al的ABC转运蛋白

从细菌到人类,生物体中最大的基因家族之一就是ABC转运蛋白家族。ABC转运蛋白是ATP驱动的泵,含有两个构成跨膜孔洞的TMD结构域,还有两个胞质核苷酸结合域(NBDs)。TMD和NBD亚基可以由单个基因(全长ABC)编码,或者由两个基因,每个基因编码一个TMD和一个NBD(半ABC)。在植物中,ABC转运蛋白参与病原体反应、表面脂质沉积、种子植酸积累和激素转运等过程。

在水稻中,OsSTAR1和OsSTAR2分别编码NBD和TMD结构域,OsSTAR1是通过对Al敏感基因座进行图位克隆鉴定出的。 OsSTAR1/OsSTAR2蛋白复合物定位于根中的内膜囊泡,在卵母细胞中表达时,起到UDP-葡萄糖转运蛋白的作用。这些含UDP-葡萄糖的囊泡融合到质膜上并将UDP-葡萄糖释放到根细胞壁中。据推测,转运的UDP-葡萄糖可用于细胞壁修饰,限制Al积累和降低Al毒性。

在拟南芥中,AtALS3是通过对Al敏感突变体als3 进行图位克隆鉴定出的,该基因编码一个质膜定位的ABC转运蛋白,仅有TMD结构域,缺乏NBD。AtALS3主要在整个植物根的皮层,叶的排水器以及韧皮部中表达。尽管尚未鉴定出AtALS3的转运底物,但Larsen等人推测性地提出AtALS3是一种Al的转运蛋白,负责将植物中的Al重新分布在远离敏感根尖的位置。此外,Huang等人提出,编码OsSTAR1的ABC转运蛋白同源物的ATP结合域的AtSTAR1可能是ALS3的功能性配体。Atstar1 突变体对Al敏感,并且表现出早花表型,但AtSTAR1的转运功能尚未确定。最新研究证明,STAR1和ALS3可以在液泡膜发生蛋白的相互作用,形成复合体,参与低磷响应。

另一种与水稻Al抗性相关的ABC转运蛋白OsALS1,是一种包含TMD和NBD结构域的半ABC转运蛋白。OsALS1在根中的表达受到Al诱导快速上调,该转运蛋白定位于液泡膜,基于水稻OsALS1敲除突变体和酵母中异源表达,证实该基因可能编码了Al的转运蛋白,推测OsALS1与质膜Al摄取转运蛋白OsNrat1串联起作用,将Al从细胞壁移入细胞,然后将其隔离在根液泡中。

3.6 Al的水通道蛋白

大多数植物物种将遇到的铝储存并隔离在根部,一小部分高积累植物物种可以将其在遇到的铝从地下运输到地上部分,如绣球花、荞麦和茶。与其他植物相比,它们可以在枝条中累积超过十倍的铝,却不表现出植物毒性。通过功能基因组学方法,在绣球花萼片组织鉴定出两个水通道蛋白基因,HmVALT和HmPALT1,编码萼片质膜和液泡铝摄取转运蛋白。 HmVALT是液泡膜定位水通道蛋白TIP亚家族的成员,而HmPALT1属于NIP亚家族。水通道蛋白通常被认为是运输非离子基质,因此由HmPALT1和HmVALT运输的铝的形式有待进一步确认。酵母中的HmPALT表达赋予Al敏感性,Al积累增加,而HmVALT表达赋予Al抗性,Al积累增加。这些结果与分别作为质膜和液泡膜Al转运蛋白的功能相一致。HmVALT可以将中性Al(OH)3 从pH=7的细胞质转移到液泡中,尽管Al(OH)3 在pH=7时的溶解度很低。关于HmPALT转运哪种Al形式仍不清楚,需要更多的研究。


4. 植物如何感受铝并调控铝抗性基因

Al抗性涉及Al对基因表达和蛋白质功能的调节。 Al诱导许多与不同机制相关的Al抗性基因的表达,包括水稻Al抗性基因 OsSTAR1/2,OsNrat1,OsFRDL4 和 OsALS1; MATE 基因SbMATE,ZmMATE,VuMATE 和 AtMATE; 和ALMT 基因AtALMT1。 Al也能调节了MATE和ALMT 这些OA转运蛋白的功能。比如,Al与小麦TaALMT1直接相互作用,影响转运蛋白的功能。但同样非常可能的是,Al通过间接作用,例如通过与未知的Al感受器结合,影响基因表达,调节蛋白质功能。

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General model illustrating putative Al-mediated signaling pathways involved in the perception and triggering of Al stress and resistance responses in roots.

我们现在知道,Al离子通过质膜转运蛋白进入植物细胞,例如水稻中的Nramp OsNrat1和绣球花中的水通道蛋白HmPALT1,并且可以与细胞内分子相互作用,包括转录因子ART1和STOP1。由于Al胁迫引发细胞稳态过程的许多变化,这些变化可能在Al抗性机制的信号传导或调节中起作用。这可能包括Al诱导的细胞溶质Ca、pH或K 的变化,这反过来可能触发Al信号通路中的其他下游成分。众所周知,Al应激导致细胞溶质Ca活性的变化,有人认为钙信号在铝信号转导中发挥作用。但是,Al介导的细胞溶质Ca 改变也可能参与引发Al抗性增加的信号传导过程。

Al胁迫也会导致植物根中活性氧(ROS)水平的增加。这通常被认为是Al毒综合征的一部分,但ROS也可能参与植物信号传导。Sivaguru等人推测,Al诱导的ROS产生可能参与细胞信号传递,增强高粱Al抗性。这种诱导是高粱特有的,因为完全诱导高粱Al耐受需要长时间的Al暴露(4-6天)。Magalhaes等表明,这种Al抗性的缓慢诱导是由于Al诱导的SbMATE基因表达的增加,导致柠檬酸分泌速率提高。Sivaguru等人的研究对暴露于铝处理1-4天的抗铝/铝敏感近等基因系高粱的根尖进行显微镜成像,观察Al诱导的ROS产生、细胞损伤、胼胝质产生(铝毒害的衡量指标)和Al积累,他们发现,由Al胁迫引起的最大细胞损伤和ROS产生特异性地位于根的DTZ中,位于根尖后1-3mm的区域,该区域发生从细胞分裂到细胞延伸的转变,是Al毒性的主要位点。高灵敏度qRT-PCR、免疫定位、激光捕获显微切割等实验结果显示,Al诱导的SbMATE基因和蛋白质表达特异性定​​位于Al抗性近等基因系中相同DTZ的表皮和外皮层细胞层,Al诱导的SbMATE表达和损伤根的恢复时间精确重合。此外,最高的Al诱导ROS产生位于相同DTZ区域。因此推测,ROS产生可能参与Al信号传导,高水平ROS触发下游事件,从而导致SbMATE蛋白丰度增加,保护该区域的根。

4.1 铝对铝抗性基因表达的调控

各种植物Al抗性基因的鉴定和随后的功能表征,已经提高了我们对这些基因如何响应Al胁迫的理解和认识。Al抗性基因表达的关键特征包括:1,抗性基因在抗性基因型/生态型中表达量更高;2,基因表达定位于根尖,这是Al毒性的部位;3,基因表达通常受Al诱导而增加(如Al诱导的ALMT和MATE基因,包括AtALMT1、BnALMT1、ScALMT、SbMATE、VuMATE1、ZmMATE1、OsFRDL4 和ScFRDL2); 4,对于Al抗性基因TaALMT1、TaMATE1B 和HvAACT1,在小麦和大麦中有更高的组成型基因表达,这些基因表达模式与苹果酸和柠檬酸外排的生理特征密切相关。从时间上看,对于ALMT和MATE基因组成型表达的植物物种,在根部Al处理和苹果酸/柠檬酸的外排之间没有明显滞后,对于那些基因表达受Al诱导的物种,最大根OA释放时间滞后于Al处理,快的像拟南芥和玉米,要2-6小时,慢的像高粱,需要4-6天。

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Models illustrating the coordinated induction of genes involved in Al tolerance.

通过对Al诱导基因表达的生物化学和分子生物学的基础研究,已经鉴定了Al诱导途径中涉及的几种顺式元件和反式作用因子。关于Al诱导抗性基因表达的转录因子,AtSTOP1和OsART1是C2H2型锌指转录因子家族的两个相关成员,其正向调节Al诱导的拟南芥中Al抗性基因的表达。通过定位克隆低pH敏感的拟南芥突变体鉴定出AtSTOP1,该突变体对Al毒性也高度敏感,但不响应其他有毒金属。AtSTOP1参与Al诱导的几种拟南芥Al抗性基因的表达,包括AtALMT1、AtMATE1和AtALS3。AtSTOP1在拟南芥中组成型表达,有可能AtSTOP1与Al结合,然后Al触发转录激活的启动。磷酸化可能在Al诱导AtALMT1表达中起作用,Al暴露可导致AtSTOP1磷酸化,其激活AtSTOP1以参与Al抗性基因的转录。最近,同一研究小组发现了AtSTOP2,这是AtSTOP1的同源基因,可与AtSTOP1合作调节拟南芥中某些Al抗性基因和低pH抗性基因的表达。

AtWRKY46是WRKY转录因子家族的成员,是AtALMT1基因表达的负调节因子,该基因可能与AtSTOP1互作,调节ALMT1的表达。AtWRKY46表达与根中的AtALMT1表达共定位,并且对许多非生物胁迫的表达响应与AtALMT1的响应相反。在响应Al时,根中减少的AtWRKY46表达与Al增加的AtALMT1表达相关,敲除AtWRKY46导致AtALMT1表达增加,苹果酸根分泌物和拟南芥Al抗性增加。 AtALMT1启动子序列含有几个推定的WRKY盒结构域,其中一些显示被WRKY46蛋白结合。这些研究结果使作者假设WRKY46是ALMT1表达的负调节因子,这可能有助于精确控制苹果酸的释放,为植物节约同化的有机碳化合物。

OsART1在序列上与AtSTOP1非常相似,在水稻中具有相似的功能。与AtSTOP1相似,它在水稻根中组成型表达,但与AtSTOP1不同的是,它仅涉及Al抗性而不作用于低pH。通过比较OsART1敲除株系与野生型之间表达谱的差异,确定了响应Al处理后,被OsART1上调的包括OsSTAR1/2在内的31个基因,还鉴定许多新的水稻Al抗性基因/蛋白质,包括OsNrat1,OsMGT1,OsCDT3和OsFRDL4。使用OsART1蛋白和Al响应性抗铝毒基因OsSTAR1的启动子,进行基于凝胶迁移率的OsSTAR1启动子定位,鉴定出了OsART1结合基序为GGN(T/g/a/C)V(C/A/g)S(C/G),作为由ART1调节的31种基因中的29种启动子的经典结合基序。

对Al抗性基因启动子顺式元件的其他研究主要集中在TaALMT1在耐受性小麦品系根尖的组成型高表达,其中Al抗性TaALMT1等位基因的启动子含有重复和三重串联重复,通过在转基因水稻愈伤组织中表达“TaALMT1启动子-GUS”验证其可作为基因表达的增强子起作用。增强抗性基因表达的序列重复的另一个可能的例子涉及高粱Al抗性基因SbMATE,其中在启动子中发现了微型反向重复转座子(MITE)。SbMATE启动子的序列分析表明,MITE的大小在不同Al抗性的高粱品系中变化很大,并且与基因表达和Al抗性相关,使得具有更高SbMATE表达的品系在启动子中具有更大的MITE插入。对小,中,大和MITE插入的序列分析表明,MITE具有重复的序列结构,并且MITE大小的增加是由这些重复的数量增加引起的。

涉及大麦Al抗性的MATE柠檬酸转运蛋白HvAACT1是由于在启动子中插入转座子,引起基因表达和转运蛋白功能改变的另一个例子。 Fujii 等发现,HvAACT1的一个主要功能是将柠檬酸释放到木质部,在那里它螯合铁以便转移到枝条。在HvAACT1启动子中鉴定出第二个HvAACT1等位基因,其具有1-kb转座子,能增加基因表达并改变基因的表达模式,使其表达于根尖表面的细胞,在那里使柠檬酸外排赋予Al抗性。 Tovkach等在小麦柠檬酸转运蛋白基因TaMATE1B的启动子中发现了类似的情况,其中转座子样扩增的TaMATE1B表达并使其表达于根尖。

黑麦中ScALMT和玉米中ZmALMT1 的拷贝数变异在增强Al抗性基因表达中起作用,耐Al的玉米基因型含有ZmMATE1的三个功能拷贝,它们是相同的并且是串联重复的。这种拷贝数扩增是玉米耐铝性的罕见事件,有趣的是,携带三拷贝等位基因的三个玉米品系都起源于南美热带地区。

4.2 铝激活的铝抗性蛋白

涉及Al抗性的根ALMT和MATE苹果酸盐/柠檬酸盐转运蛋白的生理学研究清楚地表明,Al对转运蛋白发挥功能是必需的。 这些有机酸在植物体内发挥着多重作用,Al与转运蛋白直接和/或间接相互作用以激活或增强来自根的苹果酸和柠檬酸外排,这与植物对这些重要的有机分子释放过程的控制是一致的,因此它们仅在存在Al毒性的情况下才释放到热环境中。

非洲爪蟾卵母细胞中TaALMT1和AtALMT1转运蛋白的电生理学分析证实了Al增强的苹果酸转运,证明它们在卵母细胞中的转运活性因细胞外Al的存在而增强。这类似于配体门控通道,当与ALMT蛋白相互作用时,Al充当激动配体。 Al与转运蛋白的结合可导致有利于其开放状态的构象变化,从而增加其运输活性和促进阴离子通量。

研究人员对TaALMT1的结构和功能进行了详细的分析。TaALMT1变体由所有43种带负电荷的氨基酸的定点诱变产生,以及长C-末端尾部的连续截短。对ALMT系统发育研究和TaALMT1变体的电生理学分析表明,ALMT1蛋白质的N-末端区域包含六个预测的TMD,并且预测其作用于信号传递,即使在没有C-末端结构域的情况下也足以介导苹果酸阴离子转运。然而N-末端和C-末端结构域中的肽区域都参与了Al的结合和反应。

来自卵母细胞中SbMATE,AtMATE和VuMATE的电生理学和生理学研究表明,MATE转运蛋白在没有Al的情况下,介导了组成型柠檬酸外排。这表明在根中,Al激活的柠檬酸外排可能是由于其他植物蛋白与植物中的MATE柠檬酸转运蛋白的相互作用引起的,其他蛋白质与MATE柠檬酸转运蛋白相互作用促进了Al激活的柠檬酸释放。


5. 作物铝毒抗性的遗传基础

作物中铝抗性的遗传基础,通常基于质量性状和数量性状进行遗传分类。然而在物种水平上,这种简单化对于抗铝毒机制的理解是不充分的。在小麦、高粱和大麦中鉴定出了很多遵循典型孟德尔遗传的Al抗性基因,它们还是Al抗性基因座的主效基因。然而在高粱杂交中,Al抗性基因座AltSB 的超亲分离表明在高粱中有着更复杂的遗传模式。在高粱和小麦中,还观察到从亲本到近等基因系的Al抗性转移不完全。此外在小麦中,报道了涉及由MATE同源基因调控的第二种Al抗性机制(除了TaALMT1介导的苹果酸释放),明小麦抗性比最初想象的更多样。这表明,即使在作物中存在主效基因的情况下,辅助基因座的等位基因变异也可能在某些杂交中引起Al抗性的多基因遗传。

虽然研究强调了TaALMT1和SbMATE在小麦和高粱Al抗性中的重要性,其他重要的Al抗性基因在这些物种中可能仍然未被鉴定出。大麦中发现了最明显的Al抗性单基因遗传的情况,不同遗传性Al抗性主要是由于Alp基因座处不同的等位基因造成的,在该基因座之外的遗传改良对于Al抗性的改善潜力很小 。然而大麦的GWAS证实了,尽管Alp在Al抗性中起重要作用,但是2H和7H的小麦染色体上的新区域,可能在野生西藏大麦的Al抗性中发挥作用。因此认为,自然界中作物的铝抗性,从遗传和生理学的角度来看,应该被认为是质量性状遗传。这一观点还缺乏关于农作物铝抗性的数量性状变异分子基础的详细解释。

大多数关于作物铝抗性遗传学的研究都集中在谷类作物上。这里介绍的作物,集中在高粱和小麦这些传统上被认为具有质量性状遗传的作物,以及水稻和玉米这些被认为具有数量性状遗传的物种。

5.1 高粱

在高粱种质中,高水平的铝抗性是罕见的,发生频率约为5%。因此,针对高粱适应酸性土壤的Al毒育种计划必须依赖于Al抗性供体的有意识别和引入。一个主要的半显性Al抗性基因座AltSB被定位到高粱染色体3的末端区域,这为该基因座下的抗Al基因SbMATE的图位克隆奠定了基础。

不同高粱种质对铝抗性的遗传调控表明,探索AltSB的等位基因异质性并鉴定其他铝抗性位点,有可能提高高粱的铝抗性。最重要的是,超亲分离表明,不同的铝抗性基因可能会附加地起作用,导致高水平的高粱铝抗性。高粱的SbMATE表达和铝抗性之间存在强烈的相关性,并且通过SbMATE的转录调节起作用的其他基因座似乎可能在高粱Al抗性中起作用。

Melo等人使用基因标记辅助选择,通过回交将耐受供体的AltSB基因座转移到敏感亲本中,他们观察到Al抗性表型的不完全转移,以及携带Al耐受性ALtSB等位基因的近等基因系中SbMATE表达的降低。这表明高粱基因组中额外的Al抗性基因座的存在,这些基因通过调节SbMATE的表达起作用。虽然在某些Al抗性供体中观察到Al抗性和SbMATE表达的强烈降低,但其他基因似乎主要顺式调控SbMATE的表达,在利用基因标记辅助选择的回交育种中,Al抗性供体中这些附属基因座仍然未知。

通过克隆作物中主要的抗铝基因,现在可以利用不同品种间基因的多态性,结合紧密连锁的分子标记进行分子育种。这样就能从局部适应品种中,挖掘和鉴定高粱Al抗性等位基因,避免通过外源转基因引入Al抗性。多态性分析表明,高粱铝抗性是一种罕见的性状,特别是在几内亚尾叶高粱亚群中。在与AltSB相关的杂交生产中,只选择与最高铝抗性表型相关的等位基因是不够的,考虑与AltSB相关的生成方式的多样性也是至关重要的。后续的关联作图揭示了AltSB基因座上非常高水平的连锁不平衡衰减,达到大约1,000碱基对的基础水平,这使得研究人员能够检测到内部重组事件。单倍型分析表明,AltSB中Al抗性突变可能是在西非的原始几内亚驯化物中起源的。第二个SbMATE内含子中具有最强关联信号的单核苷酸多态性(SNP),它可能是高粱 Al抗性等位基因挖掘的有用标记。

植物抵抗酸性土壤铝毒害的分子基础
Proposed breeding strategy for improving Al resistance in sorghum based on the AltSB locus (SbMATE).

上图描绘了基于上述发现的,旨在改善高粱中Al抗性的育种方案。首先根据种族分类和分子标记评估群体结构,然后使用与Al抗性相关的SNP基因座处的低频等位基因进行高通量基因分型以鉴定耐受Al的育种品系。该方法允许快速筛选大量品系以鉴定少数耐受Al的种质,显着富集显示高或中间Al抗性的种质。最后一步是确认Al抗性表型分析,因为其他基因的背景效应可能会降低SbMATE表达的,所以这一步也很重要。如果育种计划不包含耐铝高粱种质,建议引入已知的抗性供体,然后进行标记辅助选择,将等位基因特异性和侧翼标记与背景标记一起,用于标记辅助回交以改善Al抗性。

5.2 小麦

关于小麦抗铝性的早期报道表明单基因或双基因遗传参与抗铝毒,且抗性基因具有显性基因作用。然而与整倍体亲本相比,双端体种群的Al抗性降低,证明了多基因遗传结构的存在。由于Al抗性基因的分离,这可能在双亲群体中被遗漏。 1996年 Luo & Dvorak、Riede & Anderson 定位了4号染色体长臂上主要的Al抗性基因座,该基因座解释了85%的Al抗性变异。关于该基因座更精细的遗传作图,将TaALMT1定位于该基因座所在的区域,这在小麦Al抗性育种中具有重要意义。虽然TaALMT1对小麦Al抗性有显著影响,但越来越多的证据表明其他Al抗性基因的存在。尽管在小麦抗铝方面起着相对较小的作用,但在高抗的小麦品系中已经鉴定出小麦的MATE同源基因,介导不受Al诱导的柠檬酸释放。该同源基因位于4BL染色体上,这与之前在中国春小麦的二倍体分析中提出的 4BL染色体上有一个或多个Al抗性基因是一致的。虽然分子标记的数量很有限,小麦的GWAS仍鉴定出一些之前报道的Al抗性数量性状位点,包括在4DL染色体上携带TaALMT1的区域,还有在染色体3B上之前报道过的区域,以及5B染色体上的一个新区域。现在是时候去研究一下,除了TaALMT1之外,还有多少可以改善小麦Al抗性的潜力和空间。

5.3 水稻

水稻可能是最耐铝的谷物了,水稻中的铝抗性也最具复杂性。虽然在水稻中检测到Al抗性QTL位于与主要小麦抗性基因座[水稻3号染色体]和高粱AltSB [水稻2号染色体]的保守位置,但水稻对Al的高抗性似乎不是基于小麦和高粱采用的根系OA释放的Al排除机制。Yokosho等人发现,位于第1染色体的OsFRDL4是MATE的同源基因,编码柠檬酸转运蛋白,在水稻Al抗性中起作用。Magalhaes等人指出的水稻SbMATE同源基因,Os01g69010,现在已确定是OsFRDL4。接下来的问题是,如何解释参与水稻Al抗性的MATE同源基因与Al激活的OA释放和水稻对Al的抗性之间缺乏相关性。似乎Al抗性的其他机制可能在某些水稻遗传背景中掩盖了柠檬酸分泌对Al抗性的影响。为了澄清这个问题,可以使用特定的遗传资源(例如不同QTL的近等基因系)来评估每个QTL的实际贡献和相关的生理机制对水稻铝抗性的影响。

使用383份材料和两个双亲分离种群体,进行水稻铝抗性的GWAS分析,提供了水稻Al抗性和已知与Al抗性相关基因的功能变异间的联系。亚群结构解释了57%的铝抗性变异,这与高粱中铝抗性与种群结构之间的已知关系相似,与Al抗性相关的48个区域中的大多数是亚群特异性的。来自GWAS或双亲QTL作图的相关证据发现了先前涉及的Al抗性基因,即ART1,ABC转运蛋白STAR2 和 Al转运蛋白Nrat1。水稻的铝抗性表明,高水平的抗性可能是互补的基因和机制聚合的结果。

5.4 玉米

玉米中铝抗性的遗传机制通常被认为由多基因控制。生理学证据表明,玉米采用铝激活柠檬酸释放的Al外排解毒机制,但是这种机制不足以解释所有观察到的Al抗性的自然变异,所以认为玉米中存在其他Al抗性机制。关于玉米复杂的铝抗性遗传分析确定了2号、6号和8号染色体上的5个QTL,它们解释了玉米60%的Al抗性表型变异。后来对不同种群的研究也发现了5个QTL,其位置与原始研究的位置基本一致。位于6号染色体上的QTL在这两项研究中显然是保守的,因此可能含有玉米Al抗性基因。高粱SbMATE的玉米同源基因ZmMATE1,随后被鉴定为定位于6号染色体上的主要Al抗性QTL,作为Al激活的柠檬酸转运蛋白,在高抗性基因型玉米的根尖,其表达高度受Al诱导,表明ZmMATE1是6号染色体上检测到的主效QTL的基础。

连锁作图研究为玉米中多种抗铝机制提供了额外的证据。ZmNrat1是水稻Nrat1 在玉米中的同源基因,被定位在Al抗性QTL的40Mb区域,在玉米根尖中该基因的表达受Al诱导上调。将6号染色体上Al抗性QTL的主效基因ZmMATE1导入Al敏感背景,他们观察到Al抗性的显著增加,并且与上面讨论的高粱SbMATE近等基因系不同,ZmMATE1基因表达没有减少。这也印证了ZmMATE1的转录调节主要是顺式调控,和先前根据ZmMATE1表达QTL(eQTL)作图和ZmMATE1拷贝数变异的发现推断的结论一致 。因此,玉米中Al抗性的多基因调控可能反映了玉米中Al抗性机制的多样性,而不是影响ZmMATE1这一个基因表达的上位性。关于高耐铝的肯尼亚玉米系中ZmMATE1表达的研究和玉米Al抗性的一些生理学研究也表明,存在新的抗性机制和可以提供改善Al抗性的新途径。


小结

自20世纪90年代以来,已经知道涉及Al激活的根转运蛋白的Al排除机制,并且在2004年鉴定了编码小麦中该机制的苹果酸转运蛋白的基因。随后又逐渐确定了其他几种ALMT型苹果酸转运蛋白和MATE柠檬酸转运蛋白,以及关于组成型和铝诱导的ALMT和MATE表达的分子基础,包括顺式元件和反式作用因子的鉴定。此外,对水稻(最耐铝的谷物)的研究以及对少数Al高积累植物的研究,已经确定了新的Al耐受机制。涉及了对细胞壁的碳水化合物组分的改变以改变该其中的Al结合,还涉及铝特异性转运蛋白降低根细胞壁的Al毒负荷,并且吸收的Al最终存储在根或叶的液泡中,在那里解毒并与细胞的敏感组分隔离。

该领域内最新的研究涉及Al抗性的不同方面,例如Al信号传导组分的鉴定和功能以及调节Al抗性基因和蛋白质的转录、转录后和翻译后调节的途径。另外,研究人员已经开始利用Al抗性结构成分和信号通路的差异,通过分子育种和农业生物技术改良酸性土壤上的作物种质。

来源:知乎 www.zhihu.com
作者:shane

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